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科研干貨（菌種復蘇與傳代）| 菌種傳代次數(shù)必須在五代以內？
發(fā)布時間： 2025-02-07 點擊次數(shù)： 1264次一、菌種傳代次數(shù)：經(jīng)驗值還是理論值？
將菌種的傳代次數(shù)控制在5代以內是一項經(jīng)過長期實踐驗證的經(jīng)驗結論。這一指導原則的確立，旨在避免多次傳代可能導致菌種遺傳特性喪失或者發(fā)生變異。這一變異可能影響其在研究和生產(chǎn)中的穩(wěn)定性和生物活性。
通過限制傳代次數(shù)至5代以內，可以有效減少遺傳變異的風險，從而確保菌種在實驗和生產(chǎn)中保持穩(wěn)定的遺傳特性及生物活性。這不僅提升了實驗的可靠性，也保障了生產(chǎn)環(huán)節(jié)的產(chǎn)品質量。嚴格遵循傳代控制要求，不僅是對實驗結果的一種保障，也是對菌種長久穩(wěn)定利用的責任。因此，這一經(jīng)驗值在許多專業(yè)領域被廣泛認可和應用。
“5代"這一限制既是基于長期微生物學實踐經(jīng)驗的總結，也具有一定的理論依據(jù)。這一傳代次數(shù)限制的設立旨在避免由于過多傳代導致的菌種退化或遺傳變異，從而確保在研究和生產(chǎn)中所使用的菌種保持其穩(wěn)定的遺傳特性和生物活性。
這一數(shù)字并非隨意制定，而是依托大量實驗數(shù)據(jù)和實踐經(jīng)驗，認為5代是一個合理的上限，能夠有效維持菌種的穩(wěn)定性和可靠性。在許多生物技術應用中，遵循這項傳代限制已經(jīng)成為確保實驗和生產(chǎn)一致性的重要保障。通過嚴控傳代次數(shù)，科學家可以更大程度地確保結果的可重復性和產(chǎn)品的高質量。
二、菌種傳代次數(shù)必須在5代以內？超過5代是否可行？
根據(jù)微生物學常識，菌種的傳代次數(shù)與其遺傳變異率之間存在正相關關系：傳代次數(shù)越多，變異的風險也就越高。雖然技術上并非完quan禁止使用超過5代的菌種，但在超過5代后，菌種的穩(wěn)定性和可靠性可能會受到挑戰(zhàn)，增加意外問題出現(xiàn)的可能性。
只有在經(jīng)過5代傳代后，經(jīng)過細致檢查確認菌種的形態(tài)結構、生理生化特性等依然保持不變的情況下，才可考慮繼續(xù)使用。但即便如此，多個傳代在實驗過程中仍然被不建議，因為這會顯著增加變異和風險的可能性，這在實驗及生產(chǎn)中被視為一種風險行為。因此，嚴格控制菌種傳代在5代以內是基于豐富的實踐經(jīng)驗總結而來的最佳實踐方法，以確保實驗和生產(chǎn)流程在準確性和可靠性上保持不變。堅持這一經(jīng)驗法則不僅是在保證實驗結果的一致性，更是在規(guī)避不必要的研究風險。
三、限制傳代次數(shù)依據(jù)是什么？
根據(jù)《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則》，該標準規(guī)定，工作菌株的傳代次數(shù)應嚴格控制在不超過5代以內。起始代數(shù)為從菌種保藏機構獲得的標準菌株，計為第0代。這一規(guī)定的設置旨在防范多次傳代所可能導致的菌種遺傳變異風險。
在具體操作中，一次傳代被定義為將活的培養(yǎng)物接種到新的微生物生長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。無論形式如何，任何轉種操作均被視為一次傳代。為了確保實驗結果的準確性和可靠性，實驗室在有必要時需對工作菌株的特性和純度加以確認。
在實踐中，標準菌株被視為第0代，而其衍生的標準儲備菌株為第1代，隨后的儲備菌株為第2代（儲備菌株亦可作為工作菌株使用）。這意味著，工作菌株的第1代W1實際上相當于第2代菌株。根據(jù)“不超過5代"的規(guī)定，工作菌株可用的傳代代數(shù)實際為W1、W2、W3和W4。在此之后，繼續(xù)傳代將會大大增加菌種發(fā)生變異的幾率，因此不建議進行超限傳代。
四、如何妥善保藏菌種？
根據(jù)《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則》，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍（低于-30°C）等方法來保存菌種。這些方法能夠有效延長菌種的保存時間，尤其是低于-70°C的冷凍方式或冷凍干燥技術。此外，標準儲備菌株可以用于每月或每周一次的轉種，以制備工作菌株。
需要特別注意的是，一旦冷凍菌種被解凍并用于制備工作菌株后，不得再重新冷凍或再次使用原凍存管。這是為了確保菌種的穩(wěn)定性和純度不會受到不必要的影響。因此，除了嚴格控制傳代次數(shù)在5代以內以減少變異風險之外，還必須遵循適當?shù)木N保存方法，以確保菌種的質量和實驗結果的可靠性。
五、實際操作中，如何確認是那一代菌種？
①. 在實際實驗室環(huán)境中，有些實驗室對菌種管理極為嚴格，而另一些實驗室可能顯得較為混亂。由于實驗的人員頻繁更替和菌種的頻繁使用，有時會出現(xiàn)難以追蹤菌種代數(shù)的問題。面對這種普遍現(xiàn)象，我們只能以收到的菌種作為基礎，將其視為第0代。
②. 當接收到新的菌種時，我們首先需要進行簡單的形態(tài)學鑒定以及生理生化特性檢測，以評估菌株的活力。如果這些指標沒有問題，那么該菌種可以被視為F0，即母代菌種。但需要明確的是，這樣的做法并不符合《中國藥典》中規(guī)定的標準第0代菌種。
③. 這種方法僅作為臨時參考，并不適用于嚴格要求的實驗環(huán)境。為了確保實驗的穩(wěn)定性和可靠性，還是應盡力遵循規(guī)定的實驗菌種管理流程，標準化菌種的保存和使用，以避免在傳代過程中出現(xiàn)更多不確定性。
六、菌種復蘇與傳代
1. 復蘇：在無菌環(huán)境中打開冷凍干燥菌種管，加入適量的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的選擇應根據(jù)菌種的特性進行，如細菌使用營養(yǎng)肉湯，白色念珠菌使用沙堡液體培養(yǎng)基，分枝桿菌使用蘇通綜合液體培養(yǎng)基，而黑曲霉菌則使用麥芽浸膏營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。通過幾次上下吸吹的方式，使菌種充分融化并分散。之后，將菌種懸液適量滴入含有5.0 mL～10.0 mL相應培養(yǎng)液的試管中，并在適宜溫度下培養(yǎng)至規(guī)定時間。通常條件為36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h，而黑曲霉菌則需要在30℃±1℃培養(yǎng)42 h～48 h，此過程產(chǎn)出的是第1代培養(yǎng)物。
2. 傳代至第2代：利用接種環(huán)從第1代培養(yǎng)物中取樣，或直接從冷凍保存的菌種管中取出適量菌液或瓷珠，將其劃線接種于適合的培養(yǎng)基平板。根據(jù)不同的菌種，選擇適宜的培養(yǎng)基。例如，細菌使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，分枝桿菌使用改良羅氏培養(yǎng)基或其他專用復合瓊脂培養(yǎng)基，黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基。在適宜溫度下培養(yǎng)至規(guī)定時間，即為第2代培養(yǎng)物。
3. 傳代至第3代：選取第2代培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于相應的培養(yǎng)基斜面或平板。培育條件同樣依據(jù)菌種進行選擇。如需可用：細菌使用營養(yǎng)瓊脂斜面，白色念珠菌用沙堡瓊脂斜面，分枝桿菌則用改良羅氏菌培養(yǎng)基或專用復合瓊脂斜面，黑曲霉使用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基平板。這一過程得到第3代培養(yǎng)物。
4. 傳代至第4代：從第3代培養(yǎng)物取樣，接種在合適的培養(yǎng)基斜面，在適宜溫度下培養(yǎng)，直至達到期望的時間并形成第4代培養(yǎng)物。
5. 傳代記錄：繼續(xù)傳至所需代數(shù)時，需在傳代試管上明確標記菌種名稱、菌種編號、代數(shù)及傳代日期等基本信息，以便追蹤和管理菌種傳代過程的準確性。
文章來源：環(huán)凱（）轉載于“ Dr實驗助手 "公眾號；原作者~ 實驗軼。
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